1、荧光共振能量传递 （FRET）

 

    某荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光将会被屏蔽基团所吸收，并转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。

 

    2、荧光化学：

 

    安捷伦 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成*同步。

 

    二、安捷伦 荧光定量PCR技术靶基因的确定及引物和探针的设计原则

 

    1、靶基因的确定：选择检测组共有的基因以避免检测的假阴性（漏检）。

 

    2、检测片段的确定：选择检测组内的保守 （突变少）（避免假阴性）、组间特异的序列 （突变多）（避免假阳性）作为引物探针的设计位置。片段长度70-150bp。

 

    3、引物：长度17-25bp;GC含量30-80%;退火温度（Tm值）58-60℃；避免稳定的引物二聚体（特别是多联检测）及发夹结构（自由能大于-3.5kc/m）；序列不能出现连续的G，3’端避免G或C，后5个碱基内避免两个以上的G或C。

 

    4、探针：长度20-30bp（Taqman）或16-25bp（MGB）；GC含量30-80%；Tm值为68-70℃；避免稳定的二聚体及发夹结构 （自由能大于-3.5kc/m）；5’端不能是G；位置尽量靠近上游引物；选择波长差异较大（多联检测）或Fam（单联检测）的荧光标记。

 

    三、安捷伦 荧光定量PCR特点和优势

 

    1、特异性强：引物和探针的“双保险”，避免检测的假阳性。

 

    2、灵敏度高：分析PCR产物的对数期，自动化仪器收集荧光信号，避免了许多人为因素干扰。

 

    3、避免污染：全封闭反应，无须PCR后处理。

 

    4、实现定量：运用标准品获得标准曲线，结合Ct值进行准确定量。

 

    5、高效低耗：可实现一管多检。

 

    6、操作简便：在线式实时监测扩增结果，不必接触有害物质。

 

    7、快速：反应时间<1.5小时。

 

    四、安捷伦 荧光定量PCR实用意义：

 

    1、提高检测效率，缩短检测周期，提高通关速度；

 

    2、降低检测成本，提高经济与社会效益。